کروماتوگرام و ظاهر آن

ترکیبات شوییده شده به وسیله فاز متحرک به آشکارساز منتقل و به صورت منحنی¬های زنگوله¬ای شکل ثبت می¬شوند. علامت¬ها به صورت پیک¬هایی ظاهر می¬شوند که کل مجموعه را کروماتوگرام می¬نامند.

پیک¬ها اطلاعات کمی و کیفی در مورد مخلوط مورد نظر در اختیار قرار می¬دهند:

الف) کیفی: یک کروماتوگرام تنها یک داده کیفی تک که همان زمان بازداری  یا موقعیت گونه در فاز ساکن بعد از یک زمان شویش معین است، برای هرگونه موجود در اختیار می¬گذارد.

زمان بازداری۱، زمان بین تزریق نمونه و ثبت ماکسیمم پیک است.در صورتی که دو ترکیب زمان¬های بازداری متفاوتی داشته باشند می¬توان آنها را جداسازی کرد. 

پیک کوچک در سمت چپ کروماتوگرام¬ها مربوط به گونه¬ای است که به وسیله ستون نگه داشته نمی¬شود. اغلب  اوقات نمونه یا فاز متحرک حاوی یک گونه نگه داشته نشده است. 

هنگامی که آن¬ها حاوی این گونه نباشند می¬توان چنین گونه¬ای را برای کمک به شناسایی پیک افزود. زمان لازم برای رسیدن گونه نگه¬داشته نشده به آشکارساز را بعضی مواقع زمان مرده می¬نامند.

زمان بازداری یک جزء سازنده تحت شرایط کروماتوگرافی یکسان همیشه ثابت است. ابعاد ستون، نوع فاز ساکن، ترکیب فاز متحرک و سرعت جریان، اندازه نمونه و دما شرایط کروماتوگرافی را در اختیار می¬گذارند. 

بنابراین یک پیک را می¬توان با تزریق جسم مربوط و سپس مقایسه زمان¬های بازداری مشخص کرد.

ب) کمی: هم مساحت و هم ارتفاع پیک متناسب با مقدار ترکیب تزریق شده است. تجزیه کمی بر اساس مقایسه ارتفاع یا مساحت پیک آنالیت با پیک یک یا چند نمونه استاندارد استوار است. ارتفاع پیک کروماتوگرافی با متصل کردن خطوط پایه دو طرف پیک به یکدیگر به وسیله یک خط مستقیم و اندازه¬گیری فاصله عمودی این خط تا راس پیک بدست می¬آید. ارتفاع پیک¬ها با پهنای پیک¬ها نسبت عکس دارد. بنابراین اگر تغییر شرایط ستون سبب تغییر پهنای پیک طی مدت ثبت کروماتوگرام¬های نمونه و استاندارد نشود، نتایج صحیحی تنها با ارتفاع پیک¬ها به دست می¬آید. متغیرهایی که باید به دقت کنترل شوند، عبارتند از دمای ستون، سرعت جریان شوینده و سرعت تزریق نمونه. علاوه بر این باید دقت شود که از انباشتگی زیاد ستون پرهیز گردد. اثر سرعت تزریق نمونه به ویژه برای پیک¬های اولیه یک کروماتوگرام بسیار مهم است. خطاهای نسبی بین ۵ تا ۱۰ درصد ناشی از این متغیر در مواقع استفاده از این تزریق با سرنگ غیر عادی نخواهد بود. 

مساحت پیک مستقل از آثار پهن شدگی مربوط به متغیرهای ذکر شده است. از این نقطه نظر مساحت پیک پارامتر تجزیه¬ای رضایت¬بخش¬تری از ارتفاع پیک است. از طرف دیگر اندازه¬گیری ارتفاع پیک آسانتر است. اکثر دستگاه¬های کروماتوگرافی جدید به انتگرال¬گیرهای الکترونیکی رقمی مجهزند که امکان تخمین دقیق مساحت پیک¬ها را فراهم می¬کنند.

 

استانداردها

مستقیم¬ترین روش تجزیه کروماتوگرافی شامل تهیه یک سری محلول¬های استاندارد است که ترکیب شیمیایی آنها باید تقریبا مشابه مجهول باشد. کروماتوگرام¬های این محلول¬های استاندارد را به دست می¬آورند و سپس ارتفاع یا مساحت این پیک¬ها را برحسب غلظت رسم می¬کنند. مهم ترین منبع خطا در تجزیه¬ها با روش شرح داده شده در بالا، معمولا از عدم قطعیت در حجم نمونه و گاهی از سرعت تزریق ناشی می¬شود.

 

روش استاندارد درونی

بالاترین دقت برای کروماتوگرافی کمی با استفاده از استاندارد درونی به دست می¬آید که در آن از عدم قطعیت¬های ناشی از تزریق نمونه پرهیز می¬شود. در این روش حجم دقیقا معینی از جسم استاندارد درونی به هرکدام از محلول¬های نمونه و استانداردها افزوده می¬شود و نسبت مساحت یا ارتفاع پیک¬های آنالیت به استاندارد درونی به عنوان یک پارامتر تجزیه¬ای به کار می¬رود. برای اینکه این روش موفقیت¬آمیز باشد، لازم است پیک استاندارد درونی از پیک¬های تمام اجزای دیگر نمونه کاملا جدا باشد، از طرف دیگر پیک استاندارد  باید خیلی نزدیک به پیک آنالیت ظاهر شود.