آماده¬سازی دستگاه تا تزریق نمونه

 

انتخاب فاز متحرک

واضح است که فاز متحرک را باید برای خواص کروماتوگرافی آن انتخاب کرد، این فاز باید با یک فاز ساکن مناسب برهمکنش کند تا یک مخلوط را تا حد امکان با سرعت و به طور موثر جدا کند. بنابراین انتخاب باید مبتنی بر معیارهای متفاوتی باشد:

الف) گرانروی: یک حلال با گرانروی کم در مقایسه با یک حلال با گرانروی زیادتر برای یک سرعت جریان ویژه، افت فشار کمتری تولید می¬کند. این حلال همچنین کروماتوگرافی سریعتری را ممکن می¬سازد، زیرا انتقال جرم سریعتر انجام می¬شود.

ب) شفافیت در برابر UV: در صورتی که آشکارساز UV به کار گرفته شود فاز متحرک باید به طور کامل در طول موج لازم شفاف باشد، مثلا اتیل استات برای آشکارسازی در nm254  نامناسب است. 

ج) ضریب شکست: تنها هنگامی مهم است که آشکارساز ضریب شکست به کار برده شود. تفاوت بین ضرایب شکست حلال و نمونه باید هنگام کار در حدود آشکارسازی تا حد ممکن زیاد باشد.

د) نقطه جوش: در صورتی که قرار است محصول شوییده بازیابی شود و مورد عمل بعدی قرار گیرد، نقطه جوش فاز متحرک باید پایین باشد.

ه) خلوص: این معیار بسته به کاربرد مورد نظر، معنی متفاوتی دارد: عدم وجود ترکیباتی که با شیوه برگزیده آشکارسازی تداخل خواهند کرد، عدم وجود ترکیباتی که مزاحم شویش شیبی می¬شوند، عدم وجود باقیمانده-های نافرار در مورد جداسازی¬های تهیه¬ای. 

و) بی اثر بودن نسبت به ترکیبات نمونه: فاز متحرک نباید به هیچ وجه با مخلوط نمونه واکنش دهد.

ز) مقاومت در برابر خوردگی: نور باعث می¬شود که HCL از حلال¬های کلردار آزاد شود. مقادیر ناچیز آب با HCL ترکیب می¬شود تا هیدروکلریک اسید تولید کند که به فولاد زنگ نزن حمله می¬کند. خوردگی در اثر وجود حلال¬های قطبی تشدید می¬شود. تمام محلول¬های تشکیل دهنده کمپلکس با آهن، مانند یون¬های کلرید، برمید، یدید، استات، سیترات یا فرمات اثر خورندگی دارند. بافرهای نمک لیتیم نیز در pH پایین بسیار خورنده¬اند. فولاد ممکن است حتی با متانول یا استونیتریل خورده شود. در هر حال، شستشو با یک حلال عاری از یون و هالوژن، بعد از اینکه یک فاز متحرک کلردار یا یک محلول نمک به کار برده شد، پیشنهاد می¬شود.

ح) سمیت: در اینجا وظیفه هر آزمایشگاه این است که تا حد امکان از محصولات سمی دوری جوید. حلالهای کلردار ممکن است گاز فسژن بسیار سمی تولید کنند. هر کجا که ممکن است تولوئن را باید به جای بنزن(سرطانزا) به کار برد.

ج) قیمت!

به طور کلی نباید فاز متحرکی انتخاب کنیم که آشکارساز به آن فعال باشد، یعنی نباید خاصیتی داشته باشد که برای آشکارسازی به کار رود. در غیر این صورت ممکن است آثار ناخواسته خط مبنا و پیک-های اضافی در کروماتوگرام ظاهر شوند. البته از این پیشنهاد نمی¬توان در مورد آشکارسازهایی مانند آشکارساز ضریب شکست استفاده کرد.

 

تهیه فاز متحرک

انتخاب دقیق فاز متحرک باید مانند تهیه دقیق آن دنبال شود. معمولابهترین انتخاب استفاده از حلال-ها و واکنشگرهایی است که با “خلوص HPLC ” یا کیفیت مشابه فروخته می¬شوند. این حتی در مورد آب نیز چنانچه کیفیت تولید در آزمایشگاه به وسیله سیستم خالص¬سازی آب به حد کافی خوب نباشد، صادق است. حلال¬های HPLC بهترین شفافیت ممکن در برابر UV و عدم وجود آلاینده¬هایی که قدرت شویش را تغییر می¬دهند یا باعث پیک¬های اضافی در جداسازی شیبی می¬شوند را تضمین می¬کنند.در صورتی که چنین کیفیتی در دسترس نباشد، حلال¬های با خلوص کمتر را باید به وسیله تقطیر جزء به جزء یا به وسیله کروماتوگرافی جذب سطحی خالص کرد.

برای بافرها یا فازهای متحرک مختلط، شیوه تهیه باید دقیقا شرح داده شود. خواص شوینده، بسته به مرتبه مراحل لازم مانند انحلال نمک¬های بافر مختلف، تنظیم pH یا افزایش افزودنی¬های نایونی ممکن است متفاوت باشد. هنگام مخلوط کردن آب و متانول(همچنین تا حدی سایر حلال¬های امتزاج¬پذیر با آب)، اثر انقباض حجم تحقق می¬یابد: حجم مخلوط کوچکتر از حجم¬های منفرد است. بنابراین لازم است دو حلال قبل از مخلوط کردن آنها به طور جداگانه اندازه¬گیری شوند.

در صورتی که شوینده مستقیما از بطری اولیه خود به کار برده نشود، لازم است از درون یک صافی ۵/۰ یا ۸/۰ میکرومتری بلافاصله قبل از کاربرد صاف شود. همیشه خطر وجود ماده ذره¬ای وجود دارد که می¬تواند به شیرهای پمپ آسیب برساند، لوله¬های مویین و چینی¬های متخلخل را مسدود کند یا ستون را بند آورد.

به دلایل مختلف حلال¬های به کار گرفته شده برای HPLC باید گاززدایی شوند، به ویژه حلال¬های قطبی که می¬توانند مقادیر نسبتا زیادی از هوا را حل کنند(آب، حلال¬های آلی امتزاج¬پذیر با آب)، در غیر این صورت مشکلاتی پیش می¬آید: حباب¬های گاز در آشکارساز ظاهر می¬شود، در نتیجه خط مبنا با پیک¬های اضافی همراه است، دقت تجزیه تحت تاثیر قرار می¬گیرد و پیک¬ها ممکن است کوچک باشند، زیرا اکسیژن حل شده در طول موج¬های UV پایین جذب می¬کند و فلوئورسانی را فرو می¬نشاند.

حلال¬ها و شوینده¬ها را نباید در بطری¬های پلاستیکی ذخیره کرد، زیرا نرمسازها و سایر ترکیب¬های با وزن مولکولی پایین ممکن است به درون مایع نفوذ کنند. مخازن حلال¬ها باید همیشه با درپوش بسته باشند. 

 

تزریق  نمونه

تزریق نمونه یکی از جنبه¬های بحرانی HPLC است. در صورتی¬که تزریق با دقت زیادی انجام نشود، حتی بهترین ستون نتیجه جداسازی ضعیفی خواهد داشت. یک حجم بسیار کوچک از مخلوط نمونه را باید در مرکز سر ستون قرار داد و دقت لازم را به عمل آورد تا از وارد شدن همزمان هوا جلوگیری شود. حجم بسیار زیاد  باعث پرشدن بیش از حد عادی ستون و در نتیجه پهن¬شدگی نوار می¬شود.

محلول نمونه باید در صورت لزوم از درون یک مرحله صاف کردن مقدماتی بگذرد تا مطمئن شویم که هیچ جامدی در آن وجود ندارد.

 

چگونگی فرایند جداسازی

مخلوط دو جزئی A و B به بستر کروماتوگرافی اعمال می¬شود.

جزء A ترجیح می¬دهد بیشتر در فاز ساکن و جزء B بیشتر در فاز متحرک بماند.

به دنبال افزایش شوینده جدید، تعادلی جدید برقرار می¬شود: مولکول¬های نمونه در فاز متحرک به طور جزئی به وسیله سطح فاز ساکن با توجه به ضرایب توزیع خود جذب سطحی می¬شوند، در حالی¬که مولکول¬های جذب سطحی شده قبلی مجددا در فاز متحرک ظاهر می¬شوند.

بعد از تکرار این فرایند برای چندین مرتبه، دو جزء سازنده در نهایت جدا می¬شوند. جزء B که فاز متحرک را ترجیح می¬دهد در مقایسه با جزء B که تمایل دارد به فاز ساکن بچسبد سریعتر حرکت می¬کند.

در واقع هر یک از اجزاء مخلوط با توجه به ماهیت شیمیایی خود(قطبیت، جرم مولکولی، حلالیت) در ستون حرکت می¬کنند.

 

کروماتوگرام و ظاهر آن

ترکیبات شوییده شده به وسیله فاز متحرک به آشکارساز منتقل و به صورت منحنی¬های زنگوله¬ای شکل ثبت می¬شوند. علامت¬ها به صورت پیک¬هایی ظاهر می¬شوند که کل مجموعه را کروماتوگرام می¬نامند.

پیک¬ها اطلاعات کمی و کیفی در مورد مخلوط مورد نظر در اختیار قرار می¬دهند:

الف) کیفی: یک کروماتوگرام تنها یک داده کیفی تک که همان زمان بازداری  یا موقعیت گونه در فاز ساکن بعد از یک زمان شویش معین است، برای هرگونه موجود در اختیار می¬گذارد.

زمان بازداری۱، زمان بین تزریق نمونه و ثبت ماکسیمم پیک است.در صورتی که دو ترکیب زمان¬های بازداری متفاوتی داشته باشند می¬توان آنها را جداسازی کرد. 

پیک کوچک در سمت چپ کروماتوگرام¬ها مربوط به گونه¬ای است که به وسیله ستون نگه داشته نمی¬شود. اغلب  اوقات نمونه یا فاز متحرک حاوی یک گونه نگه داشته نشده است. 

هنگامی که آن¬ها حاوی این گونه نباشند می¬توان چنین گونه¬ای را برای کمک به شناسایی پیک افزود. زمان لازم برای رسیدن گونه نگه¬داشته نشده به آشکارساز را بعضی مواقع زمان مرده می¬نامند.

زمان بازداری یک جزء سازنده تحت شرایط کروماتوگرافی یکسان همیشه ثابت است. ابعاد ستون، نوع فاز ساکن، ترکیب فاز متحرک و سرعت جریان، اندازه نمونه و دما شرایط کروماتوگرافی را در اختیار می¬گذارند. 

بنابراین یک پیک را می¬توان با تزریق جسم مربوط و سپس مقایسه زمان¬های بازداری مشخص کرد.

ب) کمی: هم مساحت و هم ارتفاع پیک متناسب با مقدار ترکیب تزریق شده است. تجزیه کمی بر اساس مقایسه ارتفاع یا مساحت پیک آنالیت با پیک یک یا چند نمونه استاندارد استوار است. ارتفاع پیک کروماتوگرافی با متصل کردن خطوط پایه دو طرف پیک به یکدیگر به وسیله یک خط مستقیم و اندازه¬گیری فاصله عمودی این خط تا راس پیک بدست می¬آید. ارتفاع پیک¬ها با پهنای پیک¬ها نسبت عکس دارد. بنابراین اگر تغییر شرایط ستون سبب تغییر پهنای پیک طی مدت ثبت کروماتوگرام¬های نمونه و استاندارد نشود، نتایج صحیحی تنها با ارتفاع پیک¬ها به دست می¬آید. متغیرهایی که باید به دقت کنترل شوند، عبارتند از دمای ستون، سرعت جریان شوینده و سرعت تزریق نمونه. علاوه بر این باید دقت شود که از انباشتگی زیاد ستون پرهیز گردد. اثر سرعت تزریق نمونه به ویژه برای پیک¬های اولیه یک کروماتوگرام بسیار مهم است. خطاهای نسبی بین ۵ تا ۱۰ درصد ناشی از این متغیر در مواقع استفاده از این تزریق با سرنگ غیر عادی نخواهد بود. 

مساحت پیک مستقل از آثار پهن شدگی مربوط به متغیرهای ذکر شده است. از این نقطه نظر مساحت پیک پارامتر تجزیه¬ای رضایت¬بخش¬تری از ارتفاع پیک است. از طرف دیگر اندازه¬گیری ارتفاع پیک آسانتر است. اکثر دستگاه¬های کروماتوگرافی جدید به انتگرال¬گیرهای الکترونیکی رقمی مجهزند که امکان تخمین دقیق مساحت پیک¬ها را فراهم می¬کنند.