کروماتوگرافی گازی یک روش فیزیکی جداسازی عصاره است . با تبدیل کردن عصاره مورد نظر به بخار یا گاز و عبور آن از یک فاز ساکن اجزاء‌سازنده‌اش را از یکدیگر جدا می‌کنند. حاصل این جداسازی تعیین نوع و مقدار اجزاء سازنده درمخلوط است.یا به عبارت دیگر اطلاعات کمی و کیفی مواد موجود در عصاره را مشخص می کند.

این نوع کروماتوگرافی برای شناسایی اسانس ها و ترکیبات فرار و ترکیباتی که نقطه جوش پایین دارند استفاده می شود.

نکته : شرط جداسازی یک مخلوط بوسیله روش کروماتوگرافی گازی آن است که نمونه مورد آزمایش در حین حرارت و تبدیل شدن، به گاز تجزیه نشود .

اجزای کروماتوگرافی گازی :

۱- ستون:لوله باریک (قطرتا ۱mm) و طویل(تا ۱۶m هم می رسد) که از جنس فلز بوده و به صورت مارپیچ درون Oven (گرم کننده) قرار دارد. ستون از فاز ثابت پر می شود.هرچه طول لوله بیشتر باشد خالص سازی بهتر انجام می شود.

۲- دستگاه گرم کننده: جهت گرم کردن ستون از۳۵۰- ۵۰ درجه سانتی گراد

۳- فاز گازی : از یک گاز بی اثر مانند آرگون یا ازت می باشد که نمونه را پس از حل کردن در اتر یا هگزان از ابتدای ستون وارد فاز گازی می کنند.

۴- Detector (شناسا گر) : برای تشخیص ترکیبات خارج شده از ستون استفاده می شود و انواع مختلف دارد که یک از آنها Mass spectrometry (طیف سنج جرمی) می باشد که مستقیماً وزن مولکولی و ساختمان اجسام موجود در عصاره را تشخیص می دهد.از دتکتور های دیگر می توان به دتکتور یونیزاسیون شعله ای و دتکتور جلب کننده الکترون اشاره کرد.

روش کار کروماتوگرافی گازی:

عصاره را همراه یک گاز بی اثر ازدرون ستون حاوی ماده جاذب عبورمی دهند.گاز حامل باید یک گاز بی‌اثر باشد تا با فاز ساکن، حلال و یا نمونه واکنش ندهد، به همین دلیل معمولاَ از نیتروژن یا هلیم استفاده می‌شود. در دمای ثابت، فشار و سرعت جریان گاز به طرف ستون را با تنظیم کننده فشار و جریان سنج، ثابت نگه می‌دارند.

در کروماتوگرافی گازی، فاز متحرک یک گاز است. فاز ساکن یک ماده جاذب جامد یا مایع پوشش داده شده و یا دارای پیوند با یک جامد بر روی دیواره ستون است. اگر فاز ساکن جامد باشد، روش را کروماتوگرافی گاز- جامد (GSC) و اگر فاز ساکن مایع باشد، روش را کروماتوگرافی گاز- مایع (GLC) می‌نامند. هر چند هر دو روش در تجزیه به کار می‌روند ولی GLC بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرد.جدا شدن اجزای یک نمونه فرار در GLC بر اساس تقسیم آنها بین دو فاز مایع و گاز است. نمونه در فاز متحرک حل شده و فاز ساکن یک مایع دیرجوش است که به صورت لایه نازکی (μm 5 – 0/25) بر روی ذرات یک جامد گسترده شده است. 

نموه مورد مطالعه را با اتر یا هگزان حل کرده و به دستگاه تزریق می کنند بعد نمونه از محفظه تزریق وارد جریان گاز بی اثر شده و همراه گاز وارد ستون شده جریان می یابد و اجزای آن بر حسب ضریب توزیع خود بین دو فاز گاز-مایع (GLC) ویا گاز- جامد (GSC) تقسیم می‌شوند.. در نتیجه اجزای موجود در نمونه بر حسب تمایلی که ستون برای نگهداری آنها دارد از یکدیگر جدا شده و به وسیله عبور گاز حامل،‌اجزاء عصاره جدا می‌شوند و وارد دتکتور شده و ثبت کننده آنها را به صورت پیک هایی نشان می دهد. با مطابقت دادن هریک از پیک ها با پیک استاندارد ترکیبات بدست آمده را شناسایی می کنند.

در این نوع کروماتوگرافی ماهیت فاز ثابت و درجه حرارت عملیات بسیار مهم وتعیین کننده است

جنس فاز ثابت در ستون بسیار مهم است زیرا بر اساس جنس فاز ثابت می توان ترکیبات گوناگون را جدا کرد.قابل ذکر است که تفاوت بین ستون های مختلف به خاطر جنس فاز ثابت آنهاست . یا به عبارت دیگر جذب یا عدم جذب ترکیبات در ستون به جنس فاز ثابت بستگی دارد. مثلاً اگر جنس فاز ثابت غیر قطبی باشد وقتی نمونه تزریق می شود ترکیبات قطبی زودتر خارج می شوند وترکیبات غیرقطبی به ستون می چسبند.و دیرتر بر حسب مقدار پلاریته خود از ستون خارج می شوند. ترکیبات براساس پلاریته های مختلف جذب ستون می شوند و در زمانهای مختلف از آن خارج می شوند. 

ترکیبات فاز ثابت درکروماتوگرافی گازی 

ترکیبات غیر قطبی : 

۱- روغن های سیلیکون(۲۰۰-۲۵۰۰c)2 – پارافین (۱۰۰۰c) (می توان ستون را حرارت داد)

۳- اسکوالن (۷۵۰c)

ترکیبات نیمه قطبی:

الکل ها با نقطه جوش بالا و استرهای آنها (۱۰۰-۲۲۵۰c)


ترکیبات شدیداً قطبی :

پروپیلین گلیکول ها و استرهای مربوطه (۲۲۵۰c) 



گازهای حامل مورد استفاده در کروماتوگرافی گازی 

۱- هیدروژن ۲- هیلیوم ۳- نیتروژن ۴- آرگون



کاربرد گاز کروماتوگرافی در علم گیاهان دارویی و کشاورزی

برای بررسی روغن های فرار (اسانس ها)، اسیدهای گیاهی، برخی آلکالوئیدها (تریاک،تنباکو، شوکران و مشتقات تروپان)، برخی رزین ها،ترکیبات استروئیدی و اندازه گیری باقی مانده حشره کش ها بر روی غلات.

روش های دیگر کروماتوگرافی

ìفیلتراسیون ژلی

این روش برای جدا سازی پروتئین ها ی گیاهی کاربرد دارد و بدین صورت است که در آن ستون هایی وجود دارد که داخل آن از ماده ای به نام دگستران(سفادگس) پر شده است . دگستران پلی مری است که ساختمان میکروسکوپی آن مانند شبکه توری می باشد . زمانی که ترکیب را وارد این ستون می کنند آن را با فشار از ستون خارج می کنند و ملکول ها براساس ریزی و درشتی و وزن آنها از هم جدا می شوند. 

ìکروماتوگرافی تمایلی

این روش نیز در ستون انجام می پذیرد و از موادی خواصی در داخل ستون استفاده می شود که تمایل به جذب بعضی مواد دارند و به همین خاطر به آن کروماتوگرافی تمایلی می گویند.

ìکروماتوگرافی HPLC 

به آن کروماتوگرافی با کارایی بالا می گویند و سیستم آن نیز دارای فاز معکوس می باشد.

روشهای تشخیص ساختمان شیمیایی ترکیبات خالص شده

در ابتدا باید خلوص ماده جدا شده ثابت شود. برای اثبات خلوص راه های زیر وجود دارد:

۱- پیدا کردن Rf در شرایط استاندارد 

۲- تعیین نقطه ذوب(نقطه ذوب اجسام خالص همیشه ثابت است)

۳- تعیین نقطه جوش

۴- قدرت چرخش نور پلاریزه (وقتی که نور پلاریزه یا همان تک رنگ (دارای یک طول موج) به ترکیبات فعال نوری بتابد نور را به یک سمت منحرف می کند )

۵- وجود یک لکه در کروماتوگرام با سیستم حلال های مختلف

۶- استفاده از روش های بیوشیمیایی و رنگ سنجی

تعیین ساختمان شیمیایی با روش های طیف سنجی

برای تعیین ساختمان شیمیایی به روش طیف سنجی باید چهار مرحله اول را روی ترکیب اعمال کرد 

۱- طیف ماورای بنفش UV 

۲- طیف مادون قرمز IR 

۳- طیف رزونانس مغناطیسی هسته ای NMR

۴- اسپکترومتری جرمی Mass

۵- کریستالوگرافی  فقط در مورد اجسام متبلور به کار می رود.

کریستالو گرافی :در بعضی مواقع در عصاره ها بلور هایی تشکیل می شود که رسوب می کنند اگر کریستال ها را جمع آوری و در یک حلال حل کنند و با کمک کروماتوگرافی خلوص آن تایید شود، دوباره آنها را بلور کرده و به کمک اشعه x می توان از روی کریستالو گرافی به ساختمان سه بعدی جسم پی برد و تا حدودی به ساختمان شیمیایی جسم پی برد.

برای هر مرحله از روش های طیف سنجی چندین میلی گرم جسم نیاز می باشد. مثلاً برای اینکه یک طیف رزنانس هسته بگیرند باید ۴۰میلی گرم جسم وبرای طیف ماورای بنفش۵-۱۰ میلی گرم جسم ومادون قرمز ۱۵ -۲۰ میلی گرم و برای اسپکترو متری جرمی ۱۰میکرو گرم جسم لازم است. لذا برای تشخیص ساختمان شیمیایی نمونه حداقل ۷۰ میلی گرم جسم نیاز می باشد. 

طیف ماورای بنفش و مرئی (اولین مرحله برای تعیین ساختمان شیمیایی مواد به روش طیف سنجی ) طیف ماورای بنفش را توسط دستگاه UV اندازه گیری می کنند.

بدین صورت است که ابتدا جسم خالص شده را با حلال خاصی (الکل۹۵ درصد)حل می کنند سپس به آن اشعه ی UV می تابانند . جسم براساس گروه عاملی که در آن وجود دارد نورUV با موج های مختلفی را به خود جذب می کند . از آنجایی که هر گروه عاملی جذب مشخص دارد می توان با پی بردن به حد اکثر جذب UV به گروه عاملی ترکیب پی برد.

ترکیبات رنگی در محدوده طیف رنگی جذب دارند بنابراین برای ترکیبات رنگی طول موجnm 600-200 نیاز است و ترکیبات غیر رنگی طول موج ۲۰۰ تا ۴۰۰ نانومتر را به جسم می تابانند .در نتیجه با طول موجی که به جسم می تابانند می توان تصوری از ساختمان شیمیایی جسم بدست آورد. و برای تشخیص درست تر مراحل بعدی طیف سنجی را انجام داد.

حلالی که برای تعیین UV به کار می رود می تواند: متانول و پترولیوم اتر باشد. پترولیوم اتر برای اجسام غیر قطبی استفاده می شود. باید توجه داشت که هرگز نباید از کلروفرم و پیریدین استفاده شود زیرا خود آنها طول موج های ۲۰۰ تا۲۶۰ نانومتر را جذب می کنند در نتیجه طول موج این حلال ها محدوده حد اکثر جذب جسم مورد آزمایش را می پوشاند.و نمی توان به آن پی برد.

با پی بردن به طول موجی که از اشعه UV تابانده شده به جسم بدست می آید می توان تصوری از ترکیب شناسایی جسم مورد مطالعه بدست آورد. 

چند مثال

اگر جسمی یک باند جذبی در ناحیه ۲۵۰-۲۶۰nm داشته باشد می تواند دارای گروه فنلی باشد.

اگر جسمی سه باند مشخص در ناحیه ۴۰۰-۵۰۰nm داشته باشد یک کاروتنوئید است.

اگر جسم فاقد هرگونه جذب در طیف UV باشد علت آن وجود چربی های اشباع شده و یا وجود اسید های آلی یا اسید های آمینه خطی (در محلولهای آبی) می باشد.

 

عبدالرضا رئیسی