دستگاه HPLC

دستگاه HPLC شامل مخزن حلال، خط انتقال، پمپ با فشار زیاد، مخزن تزریق نمونه، ستون، آشکارساز می­باشد. اگر چه ستون مهم­ترین قسمت است ولی معمولا کوچکترین قطعه است.

پمپ­ها

پمپ مورد استفاده در HPLC، قابلیت رسیدن به فشار­های بالا به منظور پمپاژ کردن فاز متحرک به درون فاز ساکن(ستون) را با سرعت ۱/۰  تا ۵ یا ۱۰ میلی لیتر بر دقیقه را داراست. جریان باید عاری از هرگونه نوسان باشد، ه طوری که سرعت جریان کاملا ثابت باقی بماند. اجزای سازنده پمپ باید در مقابل خوردگی مقاوم باشند(فولادهای مختلف زنگ نزن یا تفلون). باید دقت کرد که یک پمپ گاه نباید خشک کار کند.

ستون­ها

بعد از injector ستون قرار دارد که سر آن به  injectorو انتهای آن به دتکتور(شناساگر) وصل است. اصل و اساس کروماتوگرافیHPLC جداسازی و خالص­سازی مواد، در داخل ستون صورت می­گیرد. محتوای ستون­های مختلف بر اساس نوع کاربرد آنها متفاوت است. پمپ سیستم فاز متحرک را بدون نوسان و یکنواخت پمپاژ می­کند و بدین ترتیب جریان ثابتی در کل مسیر برقرار است. همچنین این پمپ تحت فشار خاصی عمل می­کند که در واقع همان مقاومت ستون در مقابل فاز متحرک است.

اکثر ستون­های HPLC از فولاد زنگ نزن ساخته شده­اند. ستون باید در برابر فشار معمولی HPLC مقاوم و همچنین نسبت به خوردگی شیمیایی بی اثر باشد. داخل ستون نباید سطوح ناهموار و ساختار ریز تخلخل یا شیار دار داشته باشد. لوله­های شیشه­ای با جداره­ی ضخیم نیز گاهی به کار می­روند. این لوله­ها به فشار­های کمتر محدود می­شوند.

در دستگاه HPLC دو نوع ستون به کار می­رود: ستون­های تجزیه­ای و ستون­های محافظ.

الف- ستون­های تجزیه­ای:

طول اکثر ستون­های کروماتوگرافی مایع ۱۰ تا ۳۰ سانتی­متر است. معمولا ستون­ها مستقیم­اند و هر زمان که به طول­های بیشتری نیاز باشد، با متصل کردت دو یا چند ستون به یکدیگر، این کار انجام می­شود. قطر داخلی ستون­ها اغلب ۴ تا ۱۰ میلی­متر است، متداولترین اندازه ذرات پرکننده ۵ و ۱۰ میکرومتر است. شاید متداولترین ستون در حال کار این روزها، ستونی با طول ۲۵ سانتی­متر و قطر داخلی ۶/۴ میلی­متر است که با پرکننده­ای با ذرات ۵ میکرومتر پر شده است.

ب- ستون­های محافط:

اغلب یک ستون کوتاه محافظ قبل از ستون تجزیه­ای به کار می­رود تا با حذف نه تنها مواد ذره­ای و آلاینده­ها از حلال­ها، بلکه همچنین اجزای نمونه که به طور برگشت­ناپذیر با فاز ساکن پیوند می­دهند، عمر ستون تجزیه­ای را افزایش دهد. این ستون­ها مانند ستون اصلی با همان مواد یا مواد شیمیایی مشابه پر می­شوند. در صورتی که یک ستون محافظ به طور مناسب انتخاب و نصب شود، بر عملکرد جداسازی تاثیری ندارد. ستون­های محافظ در فواصل زمانی منظم، یا بعد از تعداد معینی تزریق تعویض می­شوند.

انواع پرکننده­های ستون

دو نوع پرکننده اصلی، ذرات پوسته­دار و متخلخل در کروماتوگرافی مایع به کار برده شده است. اولی از دانه­های شیشه­ای نامتخلخل کروی با قطر ۳۰ تا ۴۰ میکرومتر تشکیل شده است. یک لایه متخلخل از جنس سیلیس، آلومین و یا یک رزین تبادل یونی روی سطح این دانه­ها رسوب داده شده است. این دانه­ها ممکن است در اثر اعمال شیمیایی دارای لایه سطحی آلی شوند. اخیرا پرکننده­های پوسته­دار عمدتا در ستون­های محافظ و نه برای ستون­های تجزیه­ای به کار می­روند.

پرکننده­های ذره­ای متخلخل در کروماتوگرافی مایع از ذرات ریزی با قطر ۳ تا ۱۰ میکرومتر تشکیل می­شود. این ذرات از سیلیس، آلومین و یا یک رزین تبادل یونی تشکیل شده­اند، که نوع سیلیسی تا کنون متداولترین بوده است. ذرات سیلیس از تجمع ذرات سیلیس زیر میکرون در شرایطی سنتز می­شوند که به ذرات بزرگتر با قطر کاملا یکنواخت منجر شوند. ذرات حاصل اغلب با فیلم­های نازکی از مواد آلی پوشیده شده­اند که به طور شیمیایی و یا فیزیکی به سطح پیوند شده­اند.

جهت جریان

روی ستون پیکانی رسم شده است که جهت جریان را نشان می­دهد. ستون باید با توجه به جهت مشخص شده نصب شود. بهتر است که ستون HPLC را همیشه در یک جهت به کار برد. ستون تنها برای هدف بازسازی در جهت معکوس به کار می­رود.

مراقبت از ستون وبازسازی

ستون­های HPLC هنگامی که مورد استفاده قرار نمی­گیرند باید با حلال پر شوند، هوابندی شده و عاری از ارتعاش نگه داشته شوند. آب به دلیل مناسب بودن جهت رشد قارچ، محیط محافظ مناسبی نیست.

بعد از استفاده برای مدت طولانی، ستون ممکن است به وسیله انباشته شدن مواد جذب سطحی شده، به ویژه در ناحیه بالای ماده پرکننده، کثیف و عملکرد آن مختل شود. فراموش نکنید که ستون را با نوع فاز متحرک علامتگذاری کنید.

اجزای جدا شده پس از آنکه از انتهای ستون خارج می­شوند وارد دتکتور شده، پس از شناسایی به عنوان ضایعات دور ریخته می­شوند.

آشکارسازها(دتکتورها)

هنگامی که ترکیب از ستون شسته می­شود، آشکارساز باید قادر به شناسایی آن باشد. بنابراین، آشکارساز باید تغییر در ترکیب فاز متحرک را به طریقی نظارت و به یک علامت الکتریکی تبدیل و سپس این علامت را به صفحه نمایش انتقال دهد که در آنجا به صورت انحرافی از خط مبنا نشان داده شود.

آشکارساز ایده­آل باید شرایط زیر را داشته باشد:

۱-     باید به تمام پیک­های شوییده به طور یکسان حساس باشد.

۲-     دارای حساسیت کافی باشد.

۳-     قادر به تجزیه مقادیر ناچیز نیز باشد.

۴-     باید سریعا به پیک­های باریک که از درون سلول به سرعت عبور می­کنند به طور صحیح واکنش نشان دهد.

۵-     باید محکم، ارزان­قیمت و دستکاری آن ساده باشد.

۶-     دارای قابلیت اعتماد بالا و سهولت کاربرد باشد.

انواع آشکارساز­ها:

۱- آشکارسازهای UV

این متداولترین نوع به کار گرفته شده آشکارساز است، زیرا می­تواند نسبتا حساس باشد، تا حد زیادی تحت تاثیر افت و خیز­های دما قرار نمی­گیرد و برای شویش شیبی نیز مناسب است. به طور کلی دو نوع آشکارساز UV وجود دارد: آشکارساز Uv مجهز به فیلتر و آشکارسازهای دی­یود۱.

 ۱. Diode array detector

آشکارساز UV ترکیباتی را ثبت می­کند که نور فرابنفش یا مرئی را جذب می­کنند. در صورتی که مولکول دارای حداقل یکی از موارد زیر باشد، جذب در طول موج بالای nm 200 صورت می­گیرد:

– یک پیوند دوگانه مجاور یک اتم با یک زوج الکترون ناپیوندی

– برم، ید یا گوگرد

– یک گروه کربونیل،c=o  ، یک گروه نیترو، no۲

– دو پیوند دوگانه مزدوج، X = X  -X = X

– یک حلقه آروماتیک

 – یونهای معدنی شامل: Br-، I، NO۳، NO۲

این گروه­ها به میزانی برابر یا در طول موج یکسانی جذب نمی­کنند. شدت جذب و طول موج جذب ماکسیمم نیز تحت تاثیر گروه­های اتم مجاور در مولکول قرار می­گیرند.

آشکارساز  UV جذب محصول شویش را اندازه­گیری می­کند. فاز متحرک باید برای شفافیت نوری در طول موج لامپ آشکارساز انتخاب شود، یعنی جذب آن باید صفر باشد یا حداقل به طور الکترونیکی به صفر تنظیم شود. در این وضعیت، علامت آشکارساز خود صفر است و انتگرال­گیر به موقعیت لازم نشانش می­شود و خط مبنا را تولید می­کند. ارتفاع پیک تابعی است از ضریب جذب و غلظت جسم عبور کننده از درون سلول آشکارساز، ترکیبات با ضریب جذب مولی بزرگتر در مقایسه با ترکیبات با ضریب جذب مولی کوچکتر، در صورتی که مقادیر یکسانی ترکیب تزریق شود، پیک­های بزرگتری تولید می­کنند.

یک لامپ نور را از درون سلول­های اندازه­گیری و مرجع عبور می­دهد. دو فوتودیود شدت نور را در هر دو سلول اندازه­گیری می­کنند، سیستم الکترونیکی این علامت­ها را مقایسه و بنابراین افت و خیزها در شدت نوردهی را موازنه می­کند.

آشکارسازهای  دی­یود می­توانند همزمان محصول شویش را در چند طول موج متفاوت علاوه بر نسبت بین دو جذب اندازه­گیری کنند. این امر اطلاعات بیشتری از کروماتوگرام استخراج می­کند و داده­های مهمی برای تجزیه کیفی نمونه­های مجهول در اختیار می­گذارد.

در آشکارساز دی­یود تمام نور ابتدا از درون سلول آشکارساز عبور می­کند و سپس در یک چند فامساز (که توری یا یک منشور است) از نظر طیفی تقسیم می­شود. سپس نور طیفی به یک تراشه با تعداد زیادی (۱۰۰ تا ۱۰۰۰) دیود حساس به نو که پهلوی یکدیگر مرتب شده­اند، می­رسد. هر دیود تنها یک کسر کاملا مشخصی از اطلاعات را به دست می­آورد که به وسیله الکترونیک پردازش داده­ها خوانده می­شود.

۲- آشکارساز فلوئورسانس

ترکیباتی که فلوئورسانی دارند یا مشتقات فلوئورسان­کننده آنها را می­توان به دست آورد، می­توان با این نوع آشکارساز با حساسیت و ویژگی زیاد شناسایی کرد. حساسیت می­تواند تا حدود ۱۰۰۰ مرتبه بیشتر از آشکارسازی با UV باشد. به طور گسترده برای آشکارسازی آمینواسیدهای حاصل از آبکافت پروتئین­ها به کار می­رود.

باید دقت شود که هیچ نوع ترکیبی مانند یک حلال نامناسب یا اکسیژن که می­تواند باعث فرونشانی فلوئورسانی شود در فاز متحرک وجود نداشته باشد.

۳- آشکارساز­های الکتروشیمیایی

الکتروشیمی روشی مفید برای آشکارسازی مقادیر ناچیز ترکیبات آلی که به سهولت اکسیده یا کاهیده می­شوند در اختیار می­گذارد. حد آشکارسازی می­تواند بسیار پایین باشد و آشکارسازها هم ساده و هم ارزان­قیمت­اند. این آشکارساز از امتیازاتی مانند حساسیت بالا و دامنه کاربرد گسترده نیز برخوردار است.

۴- آشکارسازهای ضریب شکست(RI)

این آشکارسازها تمام ترکیبات را که ضرایب شکست متفاوتی با فاز متحرک خالص دارند ثبت می­کنند. هر چقدر تفاوت بین ضرایب شکست نمونه و شوینده بیشتر باشد، علامت شدیدتر خواهد بود.

آشکارسازهای ضریب شکست این امتیاز مهم را دارند که نسبت به تمام مواد حل­شده جواب می­دهند. علاوه بر این، این آشکارسازها، اعتمادپذیرند و سرعت جریان بر انها اثری ندارد. به هر حال، این آشکارسازها به دما بسیار حساس­اند و باید در دمای ثابت تا چند هزارم درجه سانتیگراد نگه داشته شوند. علاوه بر این، حساسیت انها مانند اکثر انواع آشکارسازهای دیگر نیست و عموما نمی­توان آنها را با شویش شیبی به کار برد.

حساسیت آشکارسازهای RI تقریبا ۱۰۰۰ مرتبه کمتر از آشکارسازهای UV است.

۵- آشکارسازهای پراکندگی نور(ELSD)۱

اخیرا یک نوع جدید آشکارساز همگانی به طور تجاری برای HPLC با نام آشکارساز پراکندگی نور تبخیری (ELSD) در دسترس قرار گرفته است. در این آشکارساز، سیال خروجی از ستون از داخل یک مهپاش عبور می­کند و در آنجا به وسیله جریانی از نیتروژن یا هوا به قطره-های بسیار رسزی تبدیل می­شود. سپس قطره­های بسیار ریز از داخل  لوله­ای با دمای کنترل شده عبور می­کنند و در آنجا تبخیر سطحی فاز متحرک به تشکیل ذرات بسیار ریز آنالیت منجر می­شود. سپس ابری از ذرات انالیت از داخل یک باریکه لیزری عبور دادهع می­شود. نور پراکنده در زاویه­ای عمود بر مسیر جریان به وسیله یک فوتودیود سیلیسی آشکارسازی می­شود.

امتیاز برجسته این آشکارساز این است که جواب گزارش شده آن برای تمام اجسام حل­شده نافرار تقریبا یکسان است. علاوه بر این آشکارساز در مقایسه با آشکارساز ضریب شکست بسیار حساستر است.

واضح است که فاز متحرک باید فرار باشد. در حقیقت، حلال­های آلی با نقطه جوش پایین مناسبترین فازند که اجازه می­دهند دستگاه سرعتهای جریان نسبتا زیادی را تحمل کند.

۶- آشکارسازهای زیر قرمز۲

هر مولکول آلی نور زیر قرمز رادر طول موجی جذب می­کند. هنگامی که از آشکارساز IR استفاده شود، فاز متحرک انتخاب شده باید در طول موج مورد نظر جذب نکند. استونیتریل برای آشکارسازی استر فاز متحرک مناسبی است. محدودیت عمده در استفاده از آشکارسازهای زیر قرمز به شفافیت کم تعداد زیادی از حلال­های مفید مربوط است. مثلا، نوارهای جذب زیر قرمز پهن برای آب و الکل­ها، تا حد زیادی مانع استفاده از این آشکارساز در خیلی از کاربردها می­شود.

 ۱. evaporative light scattering detector

۲. Infra Red detector

مخازن فاز متحرک و سیستم­های مورد عمل قرار دادن حلال

یک دستگاه جدید HPLC به یک و یا تعداد بیشتری مخزن شیشه­ای و یا فولاد زنگ نزن مجهز است که حاوی ۵۰۰ میلی­لیتر یا بیشتر از حلال است. مخازن اغلب به وسایلی برای حذف گازهای حل­شده، معمولا اکسیژن و نیتروژن مجهزند که با تشکیل حباب­ها سبب پهن شدن نوار می­شوند و علاوه بر این، اغلب عملکرد آشکارساز را کاهش می­دهند. همچنین اغلب اوقات سیستم وسیله­ای برای صاف کردن گرد و غبار و ذرات از حلال دارد تا از آسیب دیدن پمپ یا وسیله تزریق یا گرفتگی ستون به وسیله این ذرات جلوگیری شود.

لزومی ندارد که گاززداها و صافی­ها جزء لاینفک دستگاه HPLC باشند. مثلا یک راه مناسب آماده­سازی حلال­ها قبل از هدایت آنها به مخزن، صاف کردن حلال از داخل یک صافی ریزمنفذ در خلا است.این کار، گازها و همچنین مواد معلق را حذف می­کند.

جداسازی که یک حلال تک با ترکیب ثابت را به کار می­گیرد، شویش تک توانی نامیده می­شود. اغلب اوقات، کاررآیی جداسازی با شویش شیبی تا حد زیادی افزایش می­یابد. در این­جا دو ( و گاهی چند) سیستم حلال که قطبیت بسیار متفاوتی دارند، به کار گرفته می­شوند.

بعد از شروع شویش، نسبت دو حلال بعضی اوقات به طور پیوسته و گاهی طی چند مرحله، به طریق برنامه ریزی شده­ای، تغییر می­کند. دستگاه­های جدید HPLC اغلب به وسایلی مجهزند که حلال­ها را از دو یا چند مخزن با سرعت دائما در حال تغییر، به محفظه مخلوط کننده هدایت می­کنند، نسبت حجمی حلال­ها ممکن است به طور خطی یا نمایی با زمان تغییر کند.