مقدمه:

از آنجا که مواد در طبیعت به ندرت به صورت خالص یافت می¬شوند در آزمایشگاه و صنعت اغلب نیاز است که اجزای تشکیل دهنده یک محلول را جدا کنیم. این عمل به منظور تشخیص مواد تشکیل دهنده محلول و هم برای خالص سازی مواد به کار می¬رود.

تا اواسط قرن بیستم، جداسازی¬های تجزیه¬ای عمدتا به وسیله روش های کلاسیک مانند رسوب گیری، تقطیر، و استخراج انجام می¬شدند. در حال حاظر جداسازی¬های تجریه¬ای به ویژه نمونه¬های چند جرئی و پیچیده، اکثرا به وسیله روش¬های کروماتوگرافی و الکتروفورز انجام می¬شوند.

کروماتوگرافی یک روش جداسازی توانمند است که در تمام شاخه¬های علوم کاربردهایی دارد. کمی بعد از شروع قرن بیستم، کروماتوگرافی توسط گیاه¬شناسی روسی، میخاییل تسوت۱، ابداع و نامگذاری شد. او این فن را برای جداکردن رنگدانه¬های گیاهی مختلف از قبیل کلروفیل و رانتوفیل، با عبور دادن محلول¬هایی از این ترکیبات از داخل یک ستون شیشه¬ای که با پودر نرم کربنات کلسیم انباشته شده بود، به کار برد.

از آنجا که گونه¬های جداشده به صورت نوار¬های رنگی در ستون ظاهر شدند، عامل خروج اجزاء از داخل ستون، همان فشار اتمسفر هوا بود. وی نام کروماتوگرافی را برای این روش انتخاب کرد(در زبان یونانی کروما یعنی رنگ و گرافی یعنی نوشتن). البته این روش به نام کروماتوگرافی ستونی۲ معروف بود و بسیار وقت¬گیر و طولانی به نظر می¬رسید.

کاربرد کروماتوگرافی نه تنها به دلیل ابداع چند نوع جدید فن کروماتوگرافی، بلکه همچنین به دلیل افزایش نیاز دانشمندان به روشهای بهتر برای تشخیص اجزای مخلوط¬های پیچیده، به طور حیرت¬آوری گسترش یافته است.

۱. Mikhail Tswett
۲. Column Chromatography
فرایند کروماتوگرافی
تعریف
کروماتوگرافی دربرگیرنده گروهی از روشهای مهم و گوناگونی است که به دانشمندان اجازه می¬دهد تا اجزای نزدیک به هم یک مخلوط پیچیده را از یکدیگر جدا کنند، انجام تعداد کثیری از این جداسازی¬ها به روش¬های دیگر امکان¬پذیر نیست.

کروماتوگرافی یک فرایند جداسازی است که در آن مخلوط نمونه بین دو فاز در بستر کروماتوگرافی توزیع می¬شود. یک فاز ساکن است، در حالی که فاز دیگر از درون بستر کروماتوگرافی عبور می¬کند. فاز ساکن یک ماده جامد متخلخل فعال است که بر سطح یک جامد یا در محلی داخل ستون تثبیت شده است. فاز متحرک ممکن است یک گاز، یک مایع یا یک سیال ابر بحرانی باشد. در صورتی که از گاز استفاده شود، فرآیند را کروماتوگرافی گازی می¬نامند، فاز متحرک در تمام انواع کروماتوگرافی مایع، مایع است.فاز متحرک از درون فاز ساکن با فشار عبور داده می¬شود. دو فاز طوری انتخاب می¬شوند که اجزای نمونه خود را با درجات مختلفی بین فاز ساکن و متحرک توزیع کنند.

اجزایی که با فاز ساکن قویا نگه داشته می¬شوند فقط به آهستگی با جریان فاز متحرک حرکت می¬کنند. در مقابل، اجزایی که به طور ضعیف به وسیله فاز ساکن نگه داشته می¬شوند، به سرعت حرکت می¬کنند. در نتیجه این اختلافات در تحرک، اجزای نمونه به نوارهای مجزا جدا می¬شوند که می¬توان از آنها در تجزیه کیفی و کمی استفاده کرد.

دسته بندی روش¬های کروماتوگرافی

روش¬های کروماتوگرافی بر اساس انواع فازهای متحرک و ساکن به سه گروه عمومی کروماتوگرافی مایع، کروماتوگرافی گازی و کروماتوگرافی سیال ابر بحرانی ثقسیم می¬شود.

۱- کروماتوگرافی گازی۱:

در کروماتوگرافی گازی(GC) نمونه تبخیر و به سر ستون کروماتوگرافی تزریق می¬شود. شویش با جریانی از فاز متحرک گازی بی¬اثر انجام می¬شود. برعکس اکثر انواع دیگر کروماتوگرافی، فاز متحرک با مولکول¬های آنالیت برهم¬کنش ندارد و فقط به عنوان وسیله¬ای برای گذار مولکول¬ها از داخل ستون عمل می¬کند و تنها یک فاز(فاز ساکن) توانایی اثر¬گذاری بر مولکول¬های نمونه را دارذ. در واقع در GC مخلوط ما در حالت بخار مورد آزمایش قرار می¬گیرد.

لذا جسم ما از لحاظ حرارتی باید پایدار باشد و به طور کلی می¬توان گفت اگر در نمونه¬ها تعدیل و بهسازی صورت نگیرد، تنها برای ۲۰ درصد از مواد موجود می¬توان از GC استفاده کرد و مابقی از لحاظ حرارتی پایدار نیستند و یا اینکه اصلا فرار نمی¬باشند. از طرف دیگر موادی که بسیار قطبی و یا گروه¬های یونیزه داشته باشند در GC از خود جداسازی ضعیفی نشان می¬دهند. پس می¬توان گفت که HPLC تکنیک بهتری برای مولکول¬های بزرگ، مواد معدنی یا نمونه¬های یونی، محصولات طبیعی، مواد دارویی و بیوشیمیایی می¬باشد.

۲- کروماتوگرافی سیال ابربحرانی۲:

دمای بحرانی یک جسم دمایی است که بدون توجه به فشار، بالاتر از آن یک فاز مایع مشخص نمی-تواند وجود داشته باشد. فشار بخار یک جسم در دمای بحرانی آن، فشار بحرانی آن است. یک جسم در دما و فشار بالاتر از دما و فشار بحرانی آن را سیال ابربحرانی می¬نامند.سیال¬های ابر بحرانی چگالی، گرانروی و خواص دیگری دارند که حدواسط این خواص جسم در حالت گازی آن و حالت مایع آن است.

کروماتوگرافی با سیال ابربحرانی(SFC) هیبریدی از کروماتوگرافی گازی و مایع است که برخی از بهترین جنبه¬های هر یک را ترکیب می¬کند. این فن یک نوع مهم از کروماتوگرافی ستونی است که کاربرد آن در بسیاری از آزمایشگاه¬های صنعتی، معمولی و علمی شروع شده است.

در سال ۱۹۸۵، چند سازنده دستگاه شروع به عرضه طرح¬هایی برای این نوع از کروماتوگرافی کردند و از آن زمان تا کنون، کاربرد چنین دستگاهی با سرعت زیاد توسعه یافته است. کروماتوگرافی با سیال ابربحرانی به این دلیل مهم است که جداسازی و تعیین گروهی از ترکیبات را ممکن می¬سازد که به سهولت به وسیله کروماتوگرافی گازی یا مایع انجام نمی¬شوند.

این ترکیبات ۱) نافرارند که روش¬های کروماتوگرافی گازی اعمال¬پذیر نیست. ۲) حاوی گروه¬های عاملی نیستند که بتوان آنها را به وسیله کروماتوگرافی مایع آشکارسازی کرد. چستر تخمین زده است که تا حدود ۲۵ درصد تمام مسائل جداسازی ک امروزه یک شیمیدان با آنها روبرو است، شامل

۲ مخلوط¬های حاوی چنین گونه¬های بغرنج¬اند.

۳- کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا:

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا(HPLC)1، سریع¬ترین رشد را در بین تمام فنون جداسازی تجزیه¬ای داشته است و این به خاطر حساسیت روش، سازگاری آسان آن برای انجام اندازه¬گیری¬های کمی صحیح، مناسب بودن آن برای جداسازی گونه¬های نافرار یا ناپایدار گرمایی و مهمتر از همه کاربرد گسترده آن برای موادی که در صنعت، زمینه¬های مختلف علوم و جامعه از اهمیت زیادی برخوردارند.

مثال¬هایی از این گونه مواد عبارتند از آمینواسیدها، پروتئین¬ها، نوکلئیک¬اسیدها، هیدروکربن¬ها، داروها، آنتی¬بیوتیک¬ها، حشره-کش¬ها، استروییدها، گونه¬های آلی فلزی و گروهی از مواد گوناگون معدنی. این تکنیک در صنایع غذایی، صنعت پلیمرها، صنایع بیوشیمی و بیوتکنولوژی برای تجزیه کمی و کیفی مواد به کار می¬رود. روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا به همراه روش¬های دیگر کروماتوگرافی نظیر کروماتوگرافی گازی بیش از همه در صنایع داروسازی و در اندازه¬گیری¬های مربوط به مواد موثر داروها به کار می¬رود.

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا پرقدرت¬ترین روش کروماتوگرافی به حساب می¬آید و تجزیه¬هایی که با روشهای کروماتوگرافی دیگر، دستیابی به آن مشکل یا غیر ممکن است با استفاده از این دستگاه به راحتی امکانپذیر می¬باشد.